Квантитативната PCR со флуоресценција во реално време е метод за мерење на вкупната количина на производ по секој циклус на полимеразна верижна реакција (PCR) во реакција на засилување на ДНК користејќи флуорофор.Методот се користи за квантифицирање на специфичните секвенци на ДНК во примерокот што треба да се тестира со внатрешни или надворешни референтни методи.Од своето основање, флуоресцентните квантитативни PCR анализи станаа сè попопуларни кај наставниците во лабораторија.
Принцип на Fluorescence PCR: Fluorescence PCR, прво наречена TaqManPCR, а подоцна и Real-TimePCR, е нова техника за квантификација на нуклеинска киселина развиена од PE (PerkinElmer) во САД во 1995 година. Техниката се заснова на додавање на флуоресцентно означена сонда или соодветна флуоресцентна боја до конвенционална PCR за да ја постигне својата квантитативна функција.Принципот: како што продолжува реакцијата на ПЦР, производите на реакцијата на ПЦР се акумулираат и интензитетот на флуоресцентниот сигнал се зголемува во еднаков сооднос.Со секој циклус, се собира сигнал за интензитет на флуоресценција за да можеме да ја следиме промената на количината на производот со промената на интензитетот на флуоресценцијата и на тој начин да добиеме график на кривата на засилување на флуоресценцијата.
Општо земено, кривата на засилување на флуоресценцијата може да се подели на три фази: фаза на флуоресцентен сигнал за позадина, фаза на експоненцијално засилување на сигналот на флуоресценција и фаза на плато.За време на фазата на позадински сигнал, засилениот флуоресцентен сигнал е маскиран со флуоресцентен сигнал за позадина и промените во количината на производот не може да се утврдат.Во фазата на плато, производот за засилување повеќе не се зголемува експоненцијално, нема линеарна врска помеѓу количината на крајниот производ и почетната количина на шаблонот, а почетниот број на копијата на ДНК не може да се пресмета врз основа на конечниот износ на производот PCR.Само во фазата на експоненцијално засилување на флуоресцентниот сигнал постои линеарна врска помеѓу логаритмот на количината на производот на PCR и почетната количина на шаблонот, и можеме да избереме да го измериме ова во оваа фаза.За погодност за квантификација и споредба, два многу важни концепти се воведени во флуоресцентната квантитативна PCR техника во реално време: прагот на флуоресценција и вредноста на КТ.
Прагот е вештачки поставена вредност на кривата на засилување на флуоресценцијата.експоненцијална фаза на PCR засилување.
Ct вредност: е бројот на циклуси што ги поминал флуоресцентниот сигнал во секоја реакциона цевка за да ја достигне поставената вредност на доменот.
Односот помеѓу вредноста Ct и почетната шаблон: студиите покажаа дека вредноста Ct на секој шаблон има линеарна врска со логаритамот на бројот на почетната копија на тој шаблон, колку повеќе копии од бројот на почетната копија, толку е помал Ct вредност.Вредностите на Ct се релативно стабилни.Стандардна крива може да се направи со користење на стандард со познат број на почетна копија, каде што хоризонталната координата го претставува логаритамот на бројот на почетната копија, а вертикалната координата ја претставува вредноста Ct како што е прикажано на сликата подолу.
Затоа, со добивање на вредноста Ct на непознат примерок, бројот на почетната копија на тој примерок може да се пресмета од стандардната крива.
Вредноста на Ct не е константна и може да биде под влијание на различни примероци и различни инструменти, дури и ако истиот примерок се повторува 2 пати на истиот инструмент, вредноста на Ct може да варира.
Квантитативни флуоресцентни анализи: Квантитативните флуоресцентни анализи може да се поделат на флуоресцентни сонди и флуоресцентни бои во зависност од користените маркери.Флуоресцентните сонди ја вклучуваат технологијата Beacon (технологија на молекуларен светилник, претставена од American Tagyi), сонди TaqMan (претставени од ABI) и FRET технологија (претставувана од Roche);флуоресцентните бои вклучуваат заситени флуоресцентни бои и незаситени флуоресцентни бои, типичен претставник на незаситените флуоресцентни бои е SYBRGreen I, кој вообичаено се користи сега;заситени Типичен претставник на незаситените флуоресцентни бои е SYBRGreenⅠ;заситените флуоресцентни бои се EvaGreen, LCGreen итн.
SYBRGreenI е најчесто користена боја за врзување на ДНК за флуоресцентна PCR, која неспецифично се врзува за двоверижна ДНК.Во својата слободна состојба, SYBRGreenI емитува слаба флуоресценција, но откако ќе се врзе за двоверижна ДНК, неговата флуоресценција се зголемува 1000 пати.Затоа, вкупниот флуоресцентен сигнал емитиран од реакцијата е пропорционален на количината на присутна двоверижна ДНК и се зголемува како што се зголемува производот за засилување.
Предности на двоверижни бои за врзување на ДНК: едноставен експериментален дизајн, потребни се само 2 прајмери, нема потреба од дизајнирање сонди, нема потреба од дизајнирање на повеќе сонди за брзо тестирање на повеќе гени, способност за вршење анализа на кривата на точката на топење, тестирање на специфичноста на реакција на засилување, ниска почетна цена, добра генералност и затоа почесто се користи во истражувањата дома и во странство.
Метод на флуоресцентна сонда (Такман техника): Кога се изведува PCR засилување, се додаваат пар прајмери заедно со специфична флуоресцентна сонда.Кога сондата е недопрена, флуоресцентниот сигнал емитиран од групата известувач се апсорбира од изгасната група и не е откриен од инструментот PCR;за време на PCR засилување (во фазата на екстензија), активноста на расцепување 5'-3' на ензимот Taq ја разградува сондата ензимски, правејќи ја репортерската флуоресцентна група и згасната флуоресцентна група
Примени на флуоресцентна квантитативна PCR.
Истражување на молекуларната биологија:
1. Анализа на квантитативна нуклеинска киселина.Квантитативна и квалитативна анализа на заразни болести, откривање на патогени микроорганизми или вируси, како што е неодамнешната епидемија на грип А (H1N1), откривање на бројот на копии на гени на трансгенски растенија и животни, откривање на стапки на инактивација на генот RNAi итн.
2. Анализа на диференцијална генска експресија.Споредба на разликите во генската експресија помеѓу третираните примероци (на пр. третман со лекови, физички третман, хемиски третман итн.), разлики во изразувањето на специфичните гени во различни фази и потврда на резултатите од микронизата на cDNA или диференцијалната експресија
3. Откривање на SNP.Откривањето на единечни нуклеотидни полиморфизми е важно за проучување на индивидуалната подложност на различни болести или индивидуалниот одговор на специфични лекови, а поради генијалната структура на молекуларните светилници, штом ќе се знаат информациите за секвенцата на SNP, лесно и точно е да се користете ја оваа техника за откривање на SNP со голема брзина.
4. Откривање на метилација.Метилацијата е поврзана со многу човечки болести, особено ракот, а Лерд објави техника наречена Methylight, која ја третира ДНК пред засилување, така што неметилираниот цитозин станува урацил, а метилираниот цитозин не е засегнат, користејќи специфични прајмери и Taqman сонди за да се направи разлика помеѓу метилирана и неметилирана ДНК. .почувствителна.
Медицински истражувања:
1. Пренатална дијагноза: луѓето не можат да лекуваат наследни болести предизвикани од изменет генетски материјал, а досега може само да го намалат бројот на болни бебиња кои се раѓаат преку пренатален мониторинг за да се спречи појавата на разни наследни болести.Ова е неинвазивна метода која лесно ја прифаќаат трудниците.
2. Откривање на патоген: Флуоресцентната квантитативна PCR анализа овозможува квантитативно определување на патогени како што се гонококот, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, хуманиот папилома вирус, вирусот на херпес симплекс, вирусот на хумана имунодефициенција, вирусот на хепатитис, вирусот на инфлуенца туберкулоза, микобациозата.Ги има предностите на висока чувствителност, мала големина на примерокот, брзина и едноставност во споредба со традиционалните методи на тестирање.
3. Проценка на ефикасноста на лекот: квантитативна анализа на вирусот на хепатитис Б (ХБВ) и вирусот на хепатитис Ц (ХЦВ) покажува дека врската помеѓу вирусното оптоварување и ефикасноста на одредени лекови.Ако серумското ниво на HBV-DNA се намали за време на третманот со ламивудин, а потоа повторно се зголеми или го надмине претходното ниво, тоа е показател за мутација на вирусот.
4. Онкогенетско тестирање: Иако механизмот на развој на туморот сè уште не е јасен, широко е прифатено дека мутациите во релевантните гени се основната причина за онкогената трансформација.Зголемена експресија и мутација на онкогените може да се забележат во раните фази на многу тумори.Квантитативната ПЦР со флуоресценција во реално време не само што е ефикасна во откривање на мутации во гените, туку може и прецизно да ја открие експресијата на онкогените.Овој метод се користи за откривање на изразување на различни гени, вклучувајќи го генот на теломераза hTERT, генот WT1 за хронична гранулоцитна леукемија, онкогениот ER ген, генот PSM за рак на простата и вирусните гени поврзани со туморот.
Преведено со www.DeepL.com/Translator (бесплатна верзија)
Време на објавување: 21.06.2022