1. Ако добијам цевка со замрзнати ќелии, дали можам да ја ставам директно во течен азот за складирање?
Во многу случаи, клетките транспортирани на сув мраз (-80°C) може да се вратат во течен азот, а потоа брзо да се одмрзнат.Сепак, одржливоста на клетките може да се намали по таков третман.За некои чувствителни клеточни линии, ова може да го отежне обновувањето на клетките.Се смета дека овој феномен се должи на промената на структурата на ледените кристали во клетките како резултат на промената на температурата.Затоа се препорачува клетките да се одмрзнат и култивираат што е можно поскоро по приемот.Намалете го времето на складирање на -80°C.Оваа температура се користи само за транспорт.
2. Кои безбедносни мерки треба да се преземат при отстранување на клетките од течен азот за обновување?
Клеточните криотуби во течен азот кои не се целосно затворени и имаат течен азот што истекува во нив може да предизвикаат експлозија ако температурата на криотубата нагло се зголеми при одмрзнување.Затоа се препорачува да се носат очила и заштитни ракавици кога се отстрануваат клетките од течниот азот.За реанимација, цевката за замрзнување треба постојано да се тресе во водена бања на 37°C за целосно да се одмрзне растворот за замрзнување во рок од 1-2 минути.Потоа, избришете ја надворешната страна на епруветата со салфетка со алкохол, потоа однесете ја во ултра чиста маса и префрлете ги клетките во епрувета за центрифуга со додадени 10 ml медиум за култура, центрифугирајте на 1000 вртежи во минута 5-10 минути, фрлете ја супернатантот, додадете ја соодветната количина на медиум за култура и инокулирајте ја колбата за култура и инкубирајте во 5% CO2 инкубатор.
3. Зошто ќелиите треба да се складираат во фаза на пареа на резервоар со течен азот наместо во течна фаза?
Клетките складирани во гасната фаза на течниот азот имаат поголема веројатност да се оживеат.Додека во течната фаза на течниот азот, ако цевките за лиофилизација не се правилно запечатени или имаат протекување, директниот контакт помеѓу клетките и течниот азот може да ја загрози одржливоста на клетките по одмрзнувањето.
4. За суспензивните клетки, како да го сменам медиумот за култура?
Култивирањето на суспензивните клетки може да се направи со едноставно додавање свеж медиум (доколку дозволува просторот) или со одвојување на клетките од стариот медиум со центрифугирање (100 xg за 5 минути) и последователно повторно суспендирање на преципитираните клетки во свеж медиум.Сепак, за повеќето суспензивни клеточни линии, едноставното додавање медиум е подобар метод.Во секој случај, медиумот треба да се обнови пред клетките да ја достигнат најголемата густина на сатурација.Густината на заситеноста на клетките варира помеѓу 3 x 10 5 и 2 x 10 6 во зависност од клеточната линија и условите на културата (одмор или мешање, нивоа на оксигенација итн.).Клетките мора да се разредат до помала клеточна концентрација за да се овозможи доволно обновување на хранливите материи за да се одржи логаритамскиот раст на клетките.Ако медиумот едноставно се промени без да се намали густината на клетките, клетките брзо ќе го осиромашат медиумот и ќе умрат.Ако клетките се разредат под нивната најмала густина, тие ќе влезат во фаза на задоцнување и ќе растат многу бавно или ќе умрат.Секоја суспензивна клеточна линија има различна густина на сатурација и интервал на поминување, така што дневниот број на клетки е начин за следење на суспензивните клеточни линии*.
5. Кое е препорачаното ниво на CO2 за клеточна култура?
Иако нивоата на CO2 во системите за клеточна култура се движат од 0,03% до 40% (обично околу 0,03% CO2 во атмосферата), многу е вообичаено да нема додаден CO2 во воздухот или концентрација на CO2 од 5% до 10%.Важно е да се прилагоди концентрацијата на натриум бикарбонат во медиумот за да се балансира со нивото на CO2 во гасната фаза.Клетките произведуваат CO2 и бараат мала количина на јаглеродна киселина за раст и опстанок.Ако не се додаде CO2 и клетките се размножуваат, може да се користат 4 mM (0,34 g/L) безводен натриум бикарбонат.Сепак, капакот на колбата за култура треба да се затегне во овој момент.Ако системот за култура бара 5% или 10% CO2, користете 23,5 mM (1,97 g/L) или 47 mM (3,95 g/L) натриум бикарбонат на 37°C, соодветно, со почетна pH вредност од приближно 7,6.Под овие услови, колбата треба да се остави без капа или да се користи Петриова чинија за одржување на рамнотежа на гасот.
6. Зошто на некои клетки им е потребен натриум пируват?Колку натриум пируват треба да додадам во медиумот?
Пируватот е метаболит на органска киселина во гликолитичкиот пат* кој лесно влегува и излегува од клетката.Затоа, додавањето на натриум пируват во медиумот обезбедува и извор на енергија и извор на јаглерод за анаболизам, помага во одржување на одредени специфични клетки, помага при клонирање на клетките или е потребно кога серумските концентрации во медиумот се намалени.Натриум пируват, исто така, помага да се намали цитотоксичноста предизвикана од флуоресценција.Натриум пируват обично се додава при конечна концентрација од 1 mM.Комерцијално достапните раствори на натриум пируват обично се 100 mM раствор за складирање (100X).
Преведено со www.DeepL.com/Translator (бесплатна верзија).
Време на објавување: 21.06.2022